|
|
 |
 |
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ТИРОКСИНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
(ТироидИФА-тироксин-01)
Рекомендована Комиссией по наборам реагентов
для иммуноферментного (неинфекционные),
радиоиммунологического и других видов
иммунохимического анализа Комитета
по новой медицинской технике МЗ РФ
(протокол № 9 от 23 октября 2000 г.)
ВЗАМЕН ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ,
УТВЕРЖДЕННОЙ 16 декабря 1996 г.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «ТироидИФА-тироксин-01» предназначен для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.
1.2. Тироксин — тироидный гормон с молекулярной массой 777Да. Тироксин является одним из гормонов, синтезируемых щитовидной железой. Количественное определение концентрации тироксина в крови имеет диагностическое значение при оценке функционального состояния щитовидной железы.
1.3. Набор «ТироидИФА-тироксин-01» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40неизвестных, 6калибровочных, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ при использовании всех стрипов одновременно.
Примечание: В случае дробного применения набор может быть использован в течение месяца после вскрытия компонентов набора.
2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
В лунках, при добавлении раствора АНС-Т4, исследуемого образца и конъюгата тироксин-пероксидаза, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным тироксином сыворотки крови за связывание с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами тироксина и конъюгата тироксин-пероксидаза, причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству тироксина в образце сыворотки крови. Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата тироксин-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация тироксина в определяемых образцах.
3. СОСТАВ НАБОРА
· комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к тироксину, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к тироксину» — 1пакет;
· калибровочные пробы на основе сыворотки крови человека, содержащие известные количества тироксина; значения концентраций тироксина в калибровочных пробах указаны на этикетках флаконов — 6 флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5 мл);
· конъюгат тироксин-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е» — 1 флакон (14 мл);
· раствор 8-анилинонафтил-1-сульфокислоты, маркирован «АНС-Т4» — 1 флакон (14 мл);
· концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1 флакон (20 мл);
· раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» — 1 флакон (14 мл);
· стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» — 1флакон (14 мл);
· контрольная сыворотка на основе сыворотки крови человека с известным содержанием тироксина, маркирована «Контрольная сыворотка» — 1флакон (лиофилизованный препарат или жидкость по 0,5 мл).
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
4.1. Специфичность. Перекрестная реакция антител к тироксину с другими тироидами приведена в таблице.
4.2. Коэффициент вариации результатов определения тироксина в одном и том же образце с использованием набора «ТироидИФА-тироксин-01» не превышает 8%.
Таблица
ТИРОИД
Перекрестная реакция, %
L-Тироксин
100,0
L-Трийодтиронин
8,0
L-Дийодтирозин
0,001
4.3. Линейность. Зависимость концентрации тироксина в образцах сыворотки крови при разведении их сывороткой крови, не содержащей тироксин, имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб № 2–№ 6 и составляет +10%.
4.4. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» тироксина — соответствие измеренной концентрации тироксина предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы №3. Процент открытия составляет 90–110.
4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация тироксина в сыворотке крови человека не превышает 5 нмоль/л.
4.6. Клиническая проверка. Содержание тироксина измеряли в сыворотке крови взятой с 9 до 11часов у 40здоровых лиц в возрасте 21–45лет. Средняя концентрация тироксина составила 98 нмоль/л (53–158нмоль/л).
4.7. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций тироксина, соответствующие нормальным.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.
5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
5.4. Стоп-реагент представляет собой 1Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.
5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы и производные крови человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.
5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.
5.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ:
· Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;
· прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание со скоростью 500–800об/мин при температуре +37°С;
· пипетки полуавтоматические одноканальные с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5–50мкл; на 40–200мкл; на 200–1000мкл; на 1000–5000мкл с наконечниками;
· пипетка полуавтоматическая восьмиканальная, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300мкл, с наконечниками;
· цилиндр мерный, позволяющий отмерять 200 мл;
· стакан стеклянный вместимостью 300 мл;
· вода дистиллированная;
· бумага фильтровальная;
· перчатки резиновые или пластиковые.
7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка.
Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5мл дистиллированной воды и закрыть пробки. Выдержать флаконы в течение 10минут при комнатной температуре (+18...25°С). Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая.
Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.
7.2. Стрипы. Перед вскрытием пакет со стрипами необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 30минут. Открыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.
7.3. Промывочныйбуфер. Необходимое количество БуфераР развести дистиллированной водой в 10раз.
Например:
5мл БуфераР + 45мл дистиллированной воды.
Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5суток. Оставшийся неиспользованным БуферР хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.
7.4. Раствор АНС-Т4 готов к использованию.
7.5. Конъюгат тироксин-пероксидаза готов к использованию.
7.6. Раствор ТМБ готов к использованию.
7.7. Стоп-реагент готов к использованию.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры (+18…25°С). На последней странице приведена схема проведения анализа.
8.2. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом:
А1, А2 — №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;
В1, В2 — №2 для калибровочной пробы №1;
С1, С2 — №3 для калибровочной пробы №2;
D1, D2 — №4 для калибровочной пробы №3;
E1, E2 — №5 для калибровочной пробы №4;
F1, F2 — №6 для калибровочной пробы №5;
G1, G2 — №7 для калибровочной пробы №6;
H1, H2 — №8 для контрольной сыворотки.
8.3. Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 100мкл раствора АНС-Т4.
8.4. Внести в соответствующие лунки по 20мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20мкл исследуемой сыворотки крови в дубликатах.
8.5. Во все лунки, кроме А1 и А2, внести по 100 мкл конъюгата тироксин-пероксидаза.
8.6. Инкубировать стрипы при встряхивании в течение 1часа в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800об/мин.
8.7. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки четыре раза. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.3, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5–10сек. с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.
8.8. Немедленно внести во все лунки по 100мкл раствора ТМБ. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре (+18…25°С) в течение 15–30мин. в зависимости от степени развития окраски.
8.9. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор ТМБ, по 100мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1–2 мин.
8.10. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм.
Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для расчетов необходимо использовать формулу В/В0х100% для каждой калибровочной или исследуемой пробы, где В— среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы, В0— среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочную пробу «0 нмоль/л».
В координатах «logit-log» построить для калибровочных проб график зависимости В/В0х 100% от концентрации тироксина в калибровочных пробах (нмоль/л).
Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой (В–ВТ)/(B0–BТ)х100%, где ВТ— среднее значение оптической плотности лунок А1 и А2.
Определить содержание тироксина в пробах по калибровочному графику.
8.11. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п.8.9, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение 20 минут при температуре +2...8°С.
9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
9.1. Набор «ТироидИФА-тироксин-01» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5суток.
Срок годности набора — 12месяцев.
В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:
· стрипы хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8°C в течение всего срока годности;
· раствор АНС-Т4 хранить при температуре +2...8°С в защищенном от света месте в течение всего срока годности;
· восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца;
· жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить не более 1 месяца при температуре +2...8°С;
· конъюгат тироксин-пероксидаза и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить не более 1месяца при температуре +2...8°C;
· промывочный буфер, подготовленный к использованию, хранить закрытым не более 5суток при комнатной температуре (+18...25°С);
· БуферР и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить в течение всего срока годности при температуре +2...8°С.
9.2. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную, мутную сыворотку крови, а также сыворотку, содержащую азид натрия.
9.3. При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.
9.4. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика и рекомендуется определение концентрации тироксина в контрольной сыворотке.
9.5. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.
9.6. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.
По вопросам качества набора «ТироидИФА-тироксин-01» обращаться по адресу: 189650, г. Санкт-Петербург, п. Песочный, ул. Ленинградская, д.70/4, тел/факс: (812) 596-67-80, или в ИГКЛС НЦ ЭГКЛС МЗ РФ по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д. 14 А, тел. (095) 120-60-95.
СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА
Стадия анализа
и реагенты
Номер пары лунок в соответствии с маркировкой по п. 8.2.
1
2
3
4
5
6
7
8
9–48
Раствор АНС, мкл
—
100
100
100
100
100
100
100
100
КП № 1, мкл
—
20
—
—
—
—
—
—
—
КП № 2, мкл
—
—
20
–
—
—
—
—
—
КП № 3, мкл
—
—
—
20
—
—
—
—
—
КП № 4, мкл
—
—
—
—
20
—
—
—
—
КП № 5, мкл
—
—
—
—
—
20
—
—
—
КП № 6, мкл
—
—
—
—
—
—
20
—
—
КС, мкл
—
—
—
—
—
—
—
20
—
СХ, мкл
—
—
—
—
—
—
—
—
20
Конъюгат тироксин – пероксидаза, мкл
—
100
100
100
100
100
100
100
100
Инкубация № 1
1 час, термостатируемый шейкер, +37°С
4-кратная промывка: промывочный буфер, мкл
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
4х
300
Раствор ТМБ, мкл
100
100
100
100
100
100
100
% |
|
|
